杜氏肌营养不良症（OMIM：，Duchennemusculardystrophy）是最常见的遗传性神经肌肉疾病，它是一种X连锁隐性遗传病，由DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白功能异常导致肌细胞损伤、凋亡、坏死，典型临床症状为进行性肢体无力萎缩、运动能力下降，后期出现脊柱侧弯、呼吸力弱、扩张性心肌病等。典型体征为双侧腓肠肌假肥大，腱反射减弱或消失。该病主要发生在男孩，活产男婴中的发病率为1/~1/0，儿童期发病，随年龄增加，病情恶化，最终致残致死。其轻症表型贝氏肌营养不良（OMIM：，Beckermusculardystrophy）由同一基因缺陷所致，但基因功能部分保留，因此病情轻于DMD。该病尚无根治方法，因此需要早诊断早干预。
图源：ChaitanyaStemcellCenter
杜氏肌营养不良症致病基因DMD基因是DMD和BMD的致病基因。DMD基因定位于Xp1.-p1.1区域，是目前人类已知疾病最大的基因，全长约.4Mb，在常用转录本NM_中，包含79个外显子和78个内含子。
已知的DMD基因致病突变中[1-4]
大片段缺失约占60%。缺失可发生在该基因的任何区域，但存在个缺失热区，一个是45-55号外显子区域，另一个是-19号外显子区域，可能存在一个或者多个外显子同时缺失；重复突变约占10%。热点区域和基因缺失存在部分重叠，发生频率最多的是-7号、5-7号及16-4号外显子的重复；微小突变占比0%，可随机分布在该基因任何区域；
倒位等复杂结构变异、深部内含子突变也可能导致疾病。
案例分享临床信息4岁男性，在1岁时发病，跑步困难，双下肢无力逐渐进展，走路呈鸭步，不能蹲起，随后上肢近端肌力亦逐渐下降。早年行肌肉活检，考虑为贝氏肌营养不良。病情仍持续缓慢加重，功能性致残。曾多次行相关基因检测，均无法基因确诊，后采用长片段捕获结合三代测序技术进行检测。检测结果
注
UP代表Duplication（重复）；INV代表Inversion（倒位）
本次检测利用靶向捕获的长片段三代测序技术，检测到受检者携带该基因的一个半合子的复杂（INVDUP+DUP）变异，即DMD基因的chrX:-+chrX:-（INDUP+DUP）变异，该变异包含DMD基因中常用转录本NM_的第1号内含子的部分序列，但在转录本NM_（该转录本主要在胎儿大脑皮层和成人的骨骼肌中有表达，核糖核酸保护实验显示正常成人骨骼肌中有约0%的转录本是P-promoter全长转录本[5]）中是包含第1号外显子的全部序列和第1号内含子的部分序列，会导致1号外显子的序列（c.1_19）在上游重复出现，对编码蛋白产物的影响未知。
根据测序情况推测的变异示意图
DMD基因非常大，致病性的突变类型复杂多样，常规检测手段（如NGS、Sanger、MLPA等）无法全面检测所有突变类型，特别是复杂类型突变。DMD基因突变可发生在基因任何区域，包括启动子和深部内含子等基因调节区，这些区域不能被常规捕获测序技术（如全外，二代panel等）覆盖。北京希望组基于长读长测序技术技术开发了DMD精准检测方案，根据DMD基因的完整序列设计并合成了捕获探针，通过杂交捕获技术对DMD基因相关致病突变序列进行富集，然后利用三代测序仪（比如，Pacbio公司的sequel或OxfordNanopore公司的PromethION）进行长片段序列测定，不仅可以准确检测SNVs和InDels(≤50bp)，还可以精准检测缺失、重复、倒位、易位等结构变异（＞50bp），最大程度提高DMD的检出率，全方位满足DMD的精准基因检测。本次检测利用靶向捕获的长片段三代测序技术，检测到受检者携带该基因的一个半合子的复杂（INVDUP+DUP）变异，对于X染色体连锁隐性遗传疾病来说，半合子很大可能会引起疾病的发生。总结希望组专利技术三代全长基因诊断DMD全长基因检测（包括全部外显子、内含子、启动子及基因侧翼区）使用长片段捕获结合三代测序技术进行深度测序，以实现对全部突变类型的全覆盖，包括点突变（SNV）、插入缺失突变（Indel）、杂合/纯合/复合杂合型缺失重复突变、动态突变、复杂重组、异位、倒位、重排等所有结构变异类型的精准检测，同时还能进行单体型及最高精度（单碱基水平）的断点分析（了解确切的断点，可能对未来的基因治疗有帮助），为产前诊断打下基础，同时揭示出基因型与表型的密切关系，对判断病情及预后、临床治疗、遗传咨询都能起到较好的指导作用。方法比较参考文献[1]LimBC,LeeS,ShinJ-Y,KimJ-I,HwangH,KimKJ,HwangYS,SeoJ-S,ChaeJH:GeneticdiagnosisofDuchenneandBeckermusculardystrophyusingnext-generationsequencingtechnology:
